Si sposta zigzagando rapidamente, quasi sfarfallando. Caccia fra i 5 e i 10 metri dal suolo e le sue prede sono rappresentate da moscerini e altri insetti di piccole dimensioni che cattura con l'aiuto dell'ecolocalizzazione.  

Oltre agli ultrasuoni i pipistrelli nani emettono degli squittii acuti udibili anche dall'uomo, sia quando sono in volo che nei rifugi.
Esce al tramonto per cacciare e la durata della caccia è variabile, specialmente per quanto riguarda le femmine, che ritornano spesso alla nursery per allattare i piccoli. I pipistrelli nani possono cacciare a più riprese fino all'alba. Durante la caccia non si allontanano più di 1-2 Km dai rifugi.

I pipistrelli nani hanno rifugi estivi e rifugi invernali. D'inverno si rifugiano in vecchi edifici o ambienti ipogei. Possono formare colonie di migliaia di individui, in una grotta rumena ne sono stati contati 100.000 tutti insieme! Le colonie possono essere anche miste con altre specie di chirotteri. Durante l'inverno cadono in un letargo dal quale possono risvegliarsi nelle giornate più calde ed allora non è raro vederli compiere brevi voli durante il  giorno. Se disturbati mentre dormono cadono invece in tanatosi.
I rifugi estivi possono essere fessure nelle rocce o in muri per le femmine, che si riuniscono durante il periodo dei parti ed allevano i piccoli tutte insieme in una nursery. Gli esemplari solitari possono trovare rifugio in spazi minuscoli, nelle intercapedini delle case, nelle tapparelle delle finestre, persino negli spazi che si creano fra muri e cartelli stradali.

Occupano anche le cassette nido per uccelli nonché quelle apposite per chirotteri. I maschi riproduttori scelgono un rifugio che difendono attivamente con alte grida dagli intrusi e che ospita harem di poche femmine durante il periodo degli accoppiamenti (agosto-fine novembre). L'inseminazione non avviene però subito, ma viene rimandata a fine inverno, come nella maggior parte dei pipistrelli. La gestazione dura due-tre mesi a seconda della temperatura e delle condizioni fisiche dell'animale.

Le femmine partoriscono fra giugno e luglio uno o due piccoli. Gli adulti possono vivere fino ad 11 anni. Il pipistrello nano è probabilmente la specie di chirottero che entra più frequentemente a contatto dell'uomo e che gode di una pessima reputazione: "si attacca ai capelli", "porta sfortuna", "morde", "succhia sangue". In realtà è un ottimo compagno dell'uomo, utile all'agricoltura e "mangiatore" di zanzare, ed insieme alle altre 30 specie di pipistrelli presenti in Italia è protetto dalla legislazione nazionale fin dal 1939. 
Nessuno dei pipistrelli italiani è "un vampiro": si nutrono infatti di piccolissime quantità di sangue solo alcune specie sudamericane che parassitano il bestiame, ma non si trasformano certo in Dracula! Ed esistono inoltre alcune specie di pipistrello tropicali completamente frugivore o che si nutrono di nettare.

Lo sapevate che...

Il pipistrello nano viene considerato come una specie antropofila. E' presente infatti nei centri abitati, anche nelle grandi città, dove non è difficile vederlo volare nella luce artificiale dei lampioni.